Legge til et “bytte” for å Cas9 å gjøre CRISPR genet redigering tryggere

0
10

En stor utfordring for utviklingen av CRISPR genet redigering for bruk i mennesker er frykt for at Cas9 “saks” brukes i teknologien kan forårsake utilsiktede off-target effekter. Forskere ved University of California, Berkeley, har kommet opp med en potensiell løsning: et “bytte” mekanisme som kan holde Cas9 enzym slått av helt til den når sitt mål-området.

I en fersk studie co-forfattet av CRIPSR pioneer Jennifer Doudna og publisert i tidsskriftet Cell, UC Berkeley-teamet beskrev hvordan de brukte en engineering teknikk som kalles sirkulær permutasjon å skape Cas9 varianter, “ProCas9s,” som tillater CRISPR å være slått på bare i målrettet celler.

ProCas9s kan finne ut hvilke celler de er basert på proteases, som er enzymer som skjærer proteiner. “Det er mange av proteases som regulerer signaliserer trasé i cellene, forvandle normale celler til kreftceller, og er involvert i patogen infeksjon,” David Savage, studere senior forfatter, sa i en uttalelse. “Hvis vi kan oppfatte disse signalene, vi kan trykke inn og reagere i henhold til disse viktige veier.”

Naturlig Cas9 kan holde på i lang tid, skjæring gener, selv når det ikke trengs. En velprøvd metode for å kontrollere Cas9 innebærer å feste det til transcriptional utløsere eller repressors kjent som Cas9 fusion proteiner. Men det er en kompleks engineering task det er vanskelig å optimalisere.

Så UC Berkeley-teamet slått til runde permutasjon. Teknikken innebærer å omorganisere et protein som er den primære sekvens, koble endene, eller “termini”,” av protein med et peptid som lenker, og deretter kutte rekkefølge i en annen posisjon til å skape nye termini.

Å rote opp protein s struktur vanligvis ødelegger det, men Berkeley-teamet fant at Cas9 er svært tøyelig til runde permutasjon. Hva er mer, enzymet har flere “hotspots” som tillater det å være re-åpnet uten at det påvirker dens funksjoner. Så den nye Cas9 kan tjene som et stillas for bygging av mange avanserte fusion proteiner, team funnet.

Å utvikle teknikken som kreves for at teamet ditt perfekte peptid linker. Forskerne gjorde linker kort nok til å gjengi Cas9 inaktiv, og deretter introduserte site-specific protease-sekvenser for å skape ProCas9s. Den ProCas9s kan kun aktiveres når de er spaltet ved å matche proteases, noe som betyr at de kan fange opp og reagere på en bestemt type celle, sa forskerne.

I sin studie, er det laget viste at tilpasset ProCas9s, da sammen med høyre guide RNA kan oppdage viral proteases og montere en altruistisk forsvar mot flaviviruses som Zika og West Nile, generere massiv DNA-skade og drepe infiserte celler vert.

RELATERT: Gjør CRISPR-Cas9 genet redigering tryggere med kunstig intelligens

Dette er ett av mange forskjellige strategier forskere har foreslått for å forbedre CRISPR sikkerhet profil. For eksempel, et team ved Wellcome Sanger Institute nylig utviklet en maskin for å lære verktøy som kan forutsi hvilke mutasjoner CRISPR vil innføre i en celle. Og forskere ved University of Texas i Austin, har foreslått å erstatte Cas9 med en annen DNA-cutting protein.

Savage og hans Berkeley kolleger tror ProCas9 kan være nyttig for molekylær screening and drug discovery. Enda viktigere, det kan tjene som et redskap for “celle-type-spesifikke Cas-aktivering etter de generelle levering av en redigering komplekse til et mål vev eller organ,” team skrev i studien.

“Jeg kan se for seg ulike biomedisinske applikasjoner der Cas9-CPs og ProCas9s vil tillate oss å bedre forstå sykdomsprosesser og også gjøre det mulig for tryggere translasjonsforskning anvendelser av CRISPR-Cas-genom redigering og endring,” studiet er co-første forfatteren Christof Fellmann sa i en uttalelse.

I fremtiden, forskere planlegger å utvikle Cas9 fusion proteiner for base redigering og epigenetisk endringer. De vil også teste om ProCas9s kan være innebygd i en hel syntetisk immunsystemet, eller om de kan være følsomme for endogene proteases—i motsetning til utenlandske viral proteases—slik at de kan brukes i kreftceller.