Het toevoegen van een ‘switch’ te Cas9 te maken CRISPR-gen bewerken veiliger

0
11

Een grote uitdaging voor de ontwikkeling van CRISPR-gen bewerken voor gebruik bij de mens is de angst dat de Cas9 “schaar” gebruikt in de technologie kan leiden tot onbedoelde off-target effecten. Onderzoekers aan de Universiteit van Californië, Berkeley, zijn gekomen met een mogelijke oplossing: een “switch” mechanisme dat kon houden van de Cas9 enzym uitgeschakeld totdat hij zijn doel bereikt site.

In een recente studie co-auteur van CRIPSR pionier Jennifer Doudna en gepubliceerd in het tijdschrift Cell, de UC Berkeley team beschreven hoe ze gebruikt een techniek genaamd circulaire permutatie te maken Cas9 varianten, “ProCas9s,” waarmee CRISPR worden alleen ingeschakeld in de beoogde cellen.

ProCas9s kunt achterhalen welke cellen ze in op basis van proteasen, dat zijn enzymen die knippen eiwitten. “Er zijn een heleboel van proteasen die gelden voor het signaalpaden in de cellen, het transformeren van de normale cellen in kankercellen, en zijn betrokken bij de ziekteverwekker infectie,” David Savage, de studie senior auteur, zei in een verklaring. “Als we de betekenis van deze signalen, die we kunnen aanboren en het reageren op deze belangrijke wegen.”

Natuurlijke Cas9 kan blijven voor een lange tijd, het snijden van genen, zelfs wanneer ze niet meer nodig zijn. Een bewezen methode voor het beheersen van Cas9 gaat om het bevestigen van het transcriptionele activators of repressors bekend als Cas9 fusie-eiwitten. Maar dat is een complexe engineering task dat is moeilijk te optimaliseren.

Dus de UC Berkeley team draaide zich om circulaire permutatie. De techniek bestaat uit het rangschikken van een eiwit primaire volgorde, het verbinden van de uiteinden, of “termini” van het eiwit met een peptide linker, dan snijden de volgorde op een andere positie voor het maken van nieuwe termini.

Het verpesten van de eiwitstructuur meestal vernietigt, maar de Berkeley-team dat Cas9 is zeer buigzaam te circulaire permutatie. Wat meer is, het enzym heeft verschillende “hotspots”, waarmee hij opnieuw worden geopend zonder dat de functies. Dus de nieuwe Cas9 kan dienen als een platform voor de bouw van vele geavanceerde fusie-eiwitten, het team bedacht.

De ontwikkeling van de techniek vereist het team om de perfecte peptide linker. De onderzoekers maakten de linker kort genoeg te maken van de Cas9 inactief en vervolgens introduceerde site-specifieke protease-sequenties te maken ProCas9s. De ProCas9s kan alleen worden geactiveerd wanneer ze worden geknipt door bijpassende proteasen, wat betekent dat ze kunnen voelen en reageren op een bepaald type cel, aldus de onderzoekers.

In hun studie, het team dat op maat ProCas9s, wanneer deze is gekoppeld met de juiste gids RNA, kan detecteren virale proteasen en monteer een altruïstische verdediging tegen flaviviruses zoals Zika en West-Nijl, het genereren van enorme DNA-schade en doden van de geïnfecteerde gastheercellen.

GERELATEERD: het Maken van CRISPR-Cas9 gen bewerken veiliger met kunstmatige intelligentie

Dit is een van de vele verschillende strategieën wetenschappers hebben voorgesteld voor de verbetering van de CRISPR de veiligheid van het profiel. Bijvoorbeeld, een team van de Wellcome Sanger Institute ontwikkelde onlangs een machine learning tool die kan voorspellen welke mutaties CRISPR zal introduceren in een cel. En onderzoekers van de Universiteit van Texas in Austin hebben gesuggereerd vervangen Cas9 met een verschillende DNA-snijden-eiwit.

Savage en zijn Berkeley collega ‘ s geloven ProCas9 nuttig kan zijn voor de moleculaire screening en drug discovery. Belangrijker nog, het kan dienen als een voertuig voor ‘ cel type-specifieke Cas-activering na de algemene oplevering van een bewerkings-complex naar een doel weefsel of orgaan,” het team schreef in de studie.

“Ik kan me voorstellen dat verschillende biomedische toepassingen waar de Cas9-CPs en ProCas9s zal ons toelaten om beter te begrijpen ziekte processen en ook inschakelen voor een veiliger translationeel toepassingen van CRISPR-Cas-genoom bewerken en wijzigen,” de studie van de co-eerste auteur Christof Fellmann zei in een verklaring.

In de toekomst is het de onderzoekers zijn van plan te ontwikkelen Cas9 fusie-eiwitten voor base bewerken en epigenetische veranderingen. Zij zullen ook testen of ProCas9s kunnen worden ingebouwd in een volledig synthetische immuunsysteem en of ze gevoelig kunnen zijn voor endogene proteasen—in tegenstelling tot buitenlandse virale proteasen, zodat ze kunnen worden gebruikt in kankercellen.