Lägga till en “switch” för att Cas9 att göra CRISPR gen redigering säkrare

0
37

En stor utmaning för utvecklingen av CRISPR gen redigering för användning på människor är rädslan för att Cas9 “sax” som används i den teknik som kan orsaka oavsiktliga off-target effekter. Forskare vid University of California, Berkeley, har kommit upp med en potentiell lösning: en “switch” – mekanism som skulle kunna hålla Cas9 enzym avstängd tills den når sitt mål webbplats.

I en nyligen genomförd studie medförfattare CRIPSR pionjär Jennifer Doudna och publiceras i tidskriften Cell, UC Berkeley team beskrev hur de använde en teknik teknik som kallas cirkulär permutation för att skapa Cas9 varianter, “ProCas9s,” som gör att CRISPR att vara påslagen endast i den riktade celler.

ProCas9s kan räkna ut vilka celler de är baserade på proteaser, som är enzymer som skär proteiner. “Det finns en hel del av proteaser som reglerar signalvägar i celler, förvandla normala celler till cancerceller, och är inblandade i patogen infektion,” David Savage, studiens ledande författare, sade i ett uttalande. “Om vi kan känna dessa signaler, kan vi utnyttja och agera i enlighet med dessa viktiga vägar.”

Naturliga Cas9 kan stanna på för en lång tid, skärning gener även när det inte behövs. En beprövad metod för att kontrollera Cas9 innebär att koppla det till transkriptionell aktivatorer eller repressors känd som Cas9 fusion proteiner. Men det är en komplex teknik uppgift som är svår att optimera.

Så UC Berkeley laget vände sig till cirkulär permutation. Tekniken innebär att arrangera en proteinets primära sekvens, som förbinder topparna, eller “termini” av protein med en peptid linker, då skär den sekvens på en annan position för att skapa nya termini.

Stöka proteinets struktur oftast förstör det, men Berkeley team fann att Cas9 är mycket formbar till circular permutation. Vad är mer, det enzym som har flera “hotspots” som gör det möjligt att öppnas igen utan att påverka dess funktioner. Så den nya Cas9 kan fungera som en byggnadsställning för byggandet av många avancerade fusionsproteiner, laget förstått.

Att utveckla den teknik som krävs för laget att perfekt peptid-linker. Forskarna länkaren tillräckligt kort för att göra Cas9 inaktiva och då infördes webbplats-specifikt proteas sekvenser för att skapa ProCas9s. Den ProCas9s kan endast aktiveras när de är kluvna genom att matcha proteaser, vilket innebär att de kan känna av och reagera på en viss typ av cell, sade forskarna.

I deras studie, laget visade att skräddarsys ProCas9s, när det paras ihop med rätt vägledning RNA, kan upptäcka virala proteaser och montera en altruistisk försvar mot flaviviruses som Zika och West Nile, skapa massiv DNA-skada och döda värdens infekterade celler.

RELATERAT: Att CRISPR-Cas9 gen redigering säkrare med artificiell intelligens

Detta är en av många olika strategier forskare har föreslagit för att förbättra CRISPR är säkerhetsprofil. Till exempel, en grupp på Wellcome Sanger Institute nyligen utvecklat en maskin som lärande verktyg som kan förutsäga vilka mutationer CRISPR kommer att införa i en cell. Och forskare vid University of Texas i Austin har föreslagit att ersätta Cas9 med en annan DNA-skärning protein.

Vilde och hans Berkeley kollegor tror ProCas9 kan vara användbar för molekylära screening and drug discovery. Ännu viktigare, det kan fungera som ett fordon för “cell typ-specifika Cas-aktivering efter allmänna leverans av en redigering komplexa att ett mål vävnad eller organ,” team skrev i studien.

“Jag kan föreställa mig olika biomedicinska tillämpningar där Cas9-CPs och ProCas9s kommer att tillåta oss att bättre förstå sjukdomsprocesser och också möjliggöra säkrare translationell tillämpningar av CRISPR-Cas-genomet redigering och ändring,” studien är co-författare Stefan Fellmann sade i ett uttalande.

I framtiden, forskarna planerar att utveckla Cas9 fusionsproteiner bas för redigering och epigenetiska förändringar. De kommer också att testa om ProCas9s kan byggas in i en hela syntetiska immunförsvaret eller om de kan vara känsliga för endogena proteaser—som motsats till utländska virala proteaser, så att de kan användas i cancerceller.